0371-60972711
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2018-01-27 09:41:39 來源： 點擊：
從水中去除氮污染主要是依靠微生物的硝化-反硝化作用將氮元素轉(zhuǎn)化為N2逸出系統(tǒng).目前, 各種常用的污水處理工藝在曝氣充足的情況下, 可將大部分氨氮轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮, 去除效果較為徹底.但由于碳源的缺乏, 反硝化作用往往不徹底, 致使污水廠尾水硝態(tài)氮和TN濃度普遍較高, 從而易導(dǎo)致尾水受納水體富營養(yǎng)化.為提高反硝化效果, 需要向污水處理系統(tǒng)中投加碳源, 其中, 水溶性碳源因具有易于溶解、反應(yīng)速度快等特點而得到廣泛應(yīng)用.常用的溶解性碳源有蔗糖、甲醇、乙酸等, 但投加溶解性碳源的成本較高, 且投加量難以控制, 易造成二次污染, 從而增加了污水處理系統(tǒng)的運行維護(hù)難度.近年來, 玉米芯、稻殼、稻草、木屑(Soares et al., 1998)及秸稈提取液等天然纖維素碳源作為反硝化碳源的相關(guān)研究逐漸成為熱點.固體纖維素碳源具有碳源釋放緩慢、可長效釋碳的優(yōu)點.基于此, 本文結(jié)合前期對玉米芯反硝化碳源開展的相關(guān)研究, 將玉米芯和無機(jī)材料結(jié)合, 研發(fā)了緩釋碳源生態(tài)基質(zhì)顆粒, 并使用反硝化反應(yīng)器對其脫氮效果及脫氮機(jī)理開展研究.2 材料與方法 2.1 緩釋碳源生態(tài)基質(zhì)特性 2.1.1 生態(tài)基質(zhì)制備方法
將硅藻土、沸石粉、礦渣硅酸鹽水泥等無機(jī)材料與玉米芯按配比混勻, 玉米芯質(zhì)量比為5%, 置入滾動造粒機(jī)造粒, 在20~25 r·min-1轉(zhuǎn)速下, 使用噴霧器向造粒機(jī)內(nèi)不斷噴灑水霧, 使原料逐漸滾動成直徑9~12 mm的球形顆粒;將顆粒取出平鋪在平板上并放置于陰涼處, 每天早晚各灑水養(yǎng)護(hù)一次, 灑水至顆粒表面濕潤, 養(yǎng)護(hù)3~5 d后晾干即得到生態(tài)基質(zhì)顆粒.
2.1.2 生態(tài)基質(zhì)特性
生態(tài)基質(zhì)顆粒實現(xiàn)了天然纖維素碳源與掛膜填料的結(jié)合, 可作為反硝化生物反應(yīng)器、人工濕地等水處理技術(shù)的填料使用, 具有較高的應(yīng)用價值.本文所研制的生態(tài)基質(zhì)顆粒成品如圖 1a所示, 生態(tài)基質(zhì)顆粒表面微觀結(jié)構(gòu)(圖 1b)為類似活性炭的粗糙多孔結(jié)構(gòu), 具有比表面積大、易掛膜、傳質(zhì)性好、可緩釋碳源等特點, 其基本參數(shù)如表 1所示.
2.2 實驗裝置
實驗裝置為有機(jī)玻璃水平流反應(yīng)器, 有效容積10 L.生態(tài)基質(zhì)的鋪設(shè)方式及鋪設(shè)量如下：在裝置內(nèi)距出水端1/3位置處裝填緩釋碳源生態(tài)基質(zhì), 裝填體積為裝置體積的1/10, 其余部分填充礫石.裝填基質(zhì)后裝置內(nèi)空隙率為0.39, 實驗裝置如圖 2所示.使用計量泵進(jìn)水, 出水外排.設(shè)置一組對照, 對照組內(nèi)全部填充礫石, 其他條件與實驗組保持一致.
使用鄭州市金水河城區(qū)段(鄭州市某污水廠尾水受納水體)低碳氮比(<1)河水作為實驗用水, 水質(zhì)狀況如表 2所示.
各指標(biāo)的測試方法如下：COD測定采用HACH快速測定法;NH4+-N測定采用納氏試劑分光光度法(HJ 535—2009);NO2--N測定采用分光光度法(GB 7493-87);NO3--N測定采用酚二磺酸分光光度法(GB 7480-87);TN測定采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法(HJ 636—2012).
2.5 裝置的啟動
實驗組和對照組裝置使用計量泵進(jìn)水, 進(jìn)水流量為0.16 L·h-1, 水力停留時間為24 h.連續(xù)進(jìn)水7 d后可見礫石表面和裝置內(nèi)壁形成褐色生物膜, 裝置啟動完成.掛膜啟動完成后, 進(jìn)水流量提高至0.32 L·h-1, 水力停留時間降低至12 h, 連續(xù)進(jìn)水, 每天監(jiān)測實驗組和對照組進(jìn)出水的COD、NH4+-N、NO2--N、NO3--N和TN指標(biāo), 連續(xù)監(jiān)測25 d.
2.6 微生物多樣性分析
實驗結(jié)束后, 分別取生態(tài)基質(zhì)組和礫石對照組裝置內(nèi)相同位置的生態(tài)基質(zhì)和礫石放入樣品管, 預(yù)處理后使用試劑盒法提取DNA, 按照OMEGA試劑盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit的試劑盒使用說明書進(jìn)行提取.使用瓊脂糖凝膠檢測提取DNA的完整性.
PCR擴(kuò)增采用Miseq測序平臺的V3~V4通用引物：341F和805R.反應(yīng)體系為：2×Taq master Mix 15 μL, Bar-PCR primer F(10 μmol·L-1) 1 μL, Primer R (10 μmol·L-1) 1 μL, Genomic DNA 10~20 ng, H2O添加至30 μL.使用BIO-RAD T100TM Thermal Cyeler擴(kuò)增儀進(jìn)行第一輪擴(kuò)增, 反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性30 min, 進(jìn)行5個循環(huán)(94 ℃變性30 s, 45 ℃退火20 s, 65 ℃延伸30 s), 接著進(jìn)行20個循環(huán)(94 ℃變性30 s, 55 ℃退火20 s, 72 ℃延伸30 s), 最后72 ℃延伸5 min.第二輪擴(kuò)增引入Illumina橋式PCR兼容引物, 反應(yīng)體系為：2×Taq master Mix 15 μL, Primer F(10 μmol·L-1) 1 μL, Primer R(10 μmol·L-1) 1 μL, Genomic DNA 20 ng, H2O添加至30 μL.第二輪擴(kuò)增反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性15 s, 55 ℃退火15 s, 72 ℃延伸30 s, 進(jìn)行5個循環(huán);最后72 ℃延伸5 min.PCR結(jié)束后, PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測.對于細(xì)菌和古菌擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物和正常擴(kuò)增片段在400 bp以上的PCR產(chǎn)物, 選用0.6倍的磁珠(Agencourt AMPure XP)處理.對于真菌PCR產(chǎn)物和其他擴(kuò)增片段小于400 bp的PCR產(chǎn)物, 選用0.8倍的磁珠處理進(jìn)行DNA純化回收.使用Miseq測序平臺進(jìn)行高通量測序.
數(shù)據(jù)處理：去除Miseq測序序列中的引物接頭序列, 再根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系, 將成對的reads拼接成一條序列, 然后按照barcode標(biāo)簽序列識別并區(qū)分樣品得到各樣本數(shù)據(jù), 最后對各樣本數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控過濾, 得到各樣本有效數(shù)據(jù), 然后對數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化處理.數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計完成后進(jìn)行Alpha多樣性分析、物種分類分析和菌群差異分析.
2.7 數(shù)據(jù)處理方法
實驗數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2013和SPSS 19軟件進(jìn)行處理, 圖表使用Microsoft Excel 2013、Origin 8和AutoCAD 2014軟件繪制.
2.8 重復(fù)實驗
本實驗研究結(jié)束后, 使用同一裝置在相同參數(shù)條件下對各種形態(tài)氮的去除效果進(jìn)行重復(fù)驗證.
3 結(jié)果與討論 3.1 生態(tài)基質(zhì)對出水COD的影響
裝置掛膜啟動完成后, 兩組裝置進(jìn)、出水COD情況如圖 3所示.前10 d裝填緩釋碳源生態(tài)基質(zhì)顆粒的實驗組出水COD明顯高于對照組和進(jìn)水, 進(jìn)水COD為22~43 mg·L-1, 實驗組出水COD為32~86 mg·L-1, 對照組出水COD為20~83 mg·L-1.說明實驗期間生態(tài)基質(zhì)顆粒正在釋放碳源, 碳源釋放量在5 d后基本穩(wěn)定, 實驗組出水COD增加量基本保持在20 mg·L-1左右, 不會造成水體COD的突然升高, 實驗進(jìn)行20 d后, 加上7 d掛膜時間, 生態(tài)基質(zhì)已在水中浸泡接近1個月, 出水COD仍維持在40~55 mg·L-1, 說明生態(tài)基質(zhì)穩(wěn)定釋碳持續(xù)時間在1個月以上.
3.2 生態(tài)基質(zhì)對各種形態(tài)氮的去除效果
兩組裝置進(jìn)、出水NH4+-N、NO2--N、NO3--N和TN濃度情況如圖 4所示, 對各形態(tài)氮的去除率如圖 5所示.由圖可知, 進(jìn)水氨氮濃度為1.29~3.08 mg·L-1, 裝填生態(tài)基質(zhì)的實驗組出水氨氮濃度為0.25~1.92 mg·L-1, 裝填礫石的對照組出水氨氮濃度為0.62~1.87 mg·L-1, 實驗組對氨氮的去除率接近50%, 略高于對照組.造成這一現(xiàn)象可能有兩方面原因：一是物理吸附作用, 生態(tài)基質(zhì)顆粒的材料組成中包括沸石粉, 沸石具有吸氨能力;二是微生物作用, 生態(tài)基質(zhì)顆粒具有較大的比表面積, 表面較為粗糙, 更有利于脫氮微生物的附著生長, 基質(zhì)表面生物量更高.但硝化作用的進(jìn)行不需要碳源, 生態(tài)基質(zhì)對氨氮的去除效率沒有顯著影響.
硝態(tài)氮通過反硝化作用轉(zhuǎn)化為N2的過程可以用方程(1)表示, 該反應(yīng)分為4步(式(2)~(5)), 且中間產(chǎn)物較多, 但NO、N2O為不穩(wěn)定產(chǎn)物, 因此, 反硝化過程可使用兩步反硝化模型(Ni et al., 2008), 僅把NO2--N作為中間產(chǎn)物進(jìn)行分析.
進(jìn)水NO2--N濃度為0.33~2.05 mg·L-1, 實驗組出水NO2--N濃度為0~0.25 mg·L-1, 平均去除率為90.60%, 對照組出水NO2--N濃度為0.56~1.95 mg·L-1, NO2--N出現(xiàn)積累.進(jìn)水NO3--N濃度為8.89~12.34 mg·L-1, 實驗組出水NO3--N濃度為0.24~3.05 mg·L-1, 平均去除率為90.32%, 對照組出水NO3--N濃度為7.76~13.21 mg·L-1, 平均去除率僅為25.06%.研究表明, 亞硝態(tài)氮的積累與碳氮比、碳源種類和反應(yīng)器運行方式等因素有關(guān).傳統(tǒng)碳源中, 醇類、乙酸/乙酸鈉、葡萄糖和蔗糖碳源在碳氮比小于3時易引起NO2--N積累.而天然纖維素碳源, 特別是玉米芯碳源釋碳持續(xù)時間長, 具有良好的脫氮效果, 且不易引起NO2--N積累.生態(tài)基質(zhì)顆粒內(nèi)的玉米芯釋放的纖維素碳源使碳氮比從2.0提高到3.5左右, 充足的碳源保證了反硝化作用的順利進(jìn)行, 實驗組內(nèi)NO2--N和NO3--N的去除率均達(dá)到90%以上, 而對照組內(nèi)由于缺乏碳源, 反硝化作用受到抑制, 出水NO3--N濃度升高, NO2--N出現(xiàn)了明顯的積累現(xiàn)象.
實驗組出水TN平均去除率達(dá)到63.66%, 比對照組(25.06%)高, 這一結(jié)果與趙文莉等使用玉米芯碳源開展的反硝化脫氮實驗的TN去除率接近.在前期研究當(dāng)中, 直接將玉米芯放置于反應(yīng)器內(nèi)作為反硝化碳源, 總氮去除率與本研究基本一致, 釋碳周期可達(dá)半年以上, 但反應(yīng)器運行一段時間后, 由于玉米芯的軟化分解, 反應(yīng)器內(nèi)部出現(xiàn)基質(zhì)塌陷情況, 這一現(xiàn)象也是造成天然纖維素碳源在實際工程工藝中應(yīng)用較少的原因之一.而玉米芯碳源與無機(jī)骨架材料制成的生態(tài)基質(zhì)顆粒可直接作為反應(yīng)器內(nèi)的填料使用, 有效避免了基質(zhì)塌陷;此外, 玉米芯分解釋放完后, 生態(tài)基質(zhì)內(nèi)部出現(xiàn)的大量孔狀結(jié)構(gòu), 使生態(tài)基質(zhì)顆粒可作為良好的微生物附著載體繼續(xù)發(fā)揮作用.
水質(zhì)檢測結(jié)果表明, 實驗組對各種形態(tài)氮的去除效果均優(yōu)于對照組, 生態(tài)基質(zhì)顆粒釋放的碳源可提高碳氮比, 使反硝化作用第2階段(由NO2--N轉(zhuǎn)化為N2)的反應(yīng)順利進(jìn)行, 能夠有效地提高總氮的去除率.除碳源因素外, 導(dǎo)致實驗組和對照組亞硝態(tài)氮差別較大的另一個原因是溶解氧條件.在生態(tài)基質(zhì)顆粒中的沸石粉、硅藻土等組分為多孔介質(zhì), 其中的孔隙形成許多缺氧、厭氧的微處理區(qū), 為反硝化微生物提供了適宜的溶解氧條件, 有利于反硝化作用的進(jìn)行, 而在剛性表面礫石填料則缺少厭氧條件.
本實驗研究結(jié)束后, 使用同一裝置在相同參數(shù)條件下對各種形態(tài)氮的去除效果進(jìn)行重復(fù)驗證, 結(jié)果顯示, 生態(tài)基質(zhì)組出水NH4+-N、NO2--N、NO3--N和TN的去除率分別為33.6%、88.7%、91.1%和67.3%, 對照組的去除率(積累率)分別為21.2%、-18.7%、-10.3%和29.2%.重復(fù)實驗對各種形態(tài)氮的去除率及濃度變化趨勢與本次實驗基本一致.
3.3 生態(tài)基質(zhì)對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響 3.3.1 Alpha多樣性分析
Alpha多樣性是指一個特定區(qū)域或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的物種多樣性.將相似度大于97%的序列歸為一個OTU, 進(jìn)行后續(xù)分析, 計算各個樣本的相關(guān)統(tǒng)計和分析指數(shù), 包括：Chao1指數(shù)、覆蓋率(Coverage)、香農(nóng)指數(shù)(Shannon)和辛普森指數(shù)(Simpson)等, 結(jié)果如表 4所示.結(jié)果中兩組樣本覆蓋率(Coverage)均在0.95以上, 說明本次實驗取樣合理, 測序的工作完成較好.生態(tài)基質(zhì)組chao1指數(shù)大于礫石組, 表明生態(tài)基質(zhì)組的物種總數(shù)更大.香農(nóng)指數(shù)(Shannon)和辛普森指數(shù)(Simpson)分別體現(xiàn)樣品中物種的均勻度和多樣性.生態(tài)基質(zhì)組的香農(nóng)指數(shù)大于礫石組, 辛普森指數(shù)小于礫石組, 表明生態(tài)基質(zhì)組的物種均勻度和物種豐富度高于礫石組.生態(tài)基質(zhì)顆粒釋放的碳源對反應(yīng)器內(nèi)的菌種組成有明顯影響, 生態(tài)基質(zhì)組反應(yīng)器內(nèi)微生物群落多樣性高于對照組.
為說明生態(tài)基質(zhì)組和礫石組微生物組成的差異情況, 繪制屬水平下的物種豐度熱圖, 結(jié)果如圖 6所示.圖 6中每一列代表一個樣本, 行代表菌屬群落, 顏色塊代表菌屬相對豐度值, 顏色越紅表示相對豐度越高, 顏色越藍(lán)代表相對豐度越低.由圖 6可以看出, 生態(tài)基質(zhì)組中Acinetobacter、Exiguobacterium、假單胞菌屬(Pseudomonas)、熱單胞菌屬(Thermomonas)、Mangroviflexus、叢毛單胞菌屬(Comamonas)、固氮螺菌屬(Azospira)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、弗拉托氏菌屬(Frateuria)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、Formivibrio、Saccharibacillus、Cellulosilyticum等菌屬相對豐度較高.其中, 熱單胞菌屬(Thermomonas)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)、Dechloromonas、陶厄氏菌屬(Thauera)均已證實與反硝化有關(guān).
值得指出的是, 生態(tài)基質(zhì)組中出現(xiàn)了與纖維素降解有關(guān)的Cellulosilyticum菌屬和梭狀芽孢桿菌(Clostridium)兩個菌屬, Cellulosilyticum菌屬曾在牛瘤胃中分離出, 可以分解纖維素.這與玉米芯釋放的纖維素碳源有直接關(guān)系, 玉米芯釋放的纖維素被分解后更易被異養(yǎng)反硝化微生物利用, 促進(jìn)反硝化作用的進(jìn)行.
3.3.3 樣本間差異分析
NMDS非度量多維尺度分析：非度量多維尺度分析法是一種將多維空間的研究對象(樣本或變量)簡化到低維空間進(jìn)行定位、分析和歸類, 同時又保留對象間原始關(guān)系的數(shù)據(jù)分析方法, 常用于比對樣本組之間的差異, 可以基于進(jìn)化關(guān)系或數(shù)量距離矩陣.生態(tài)基質(zhì)組和礫石組樣本間的非度量多維尺度分析結(jié)果如圖 7所示, 圖中橫坐標(biāo)表示基于進(jìn)化距離矩陣的數(shù)值(NMDS1), 縱坐標(biāo)表示基于數(shù)量距離矩陣的數(shù)值(NMDS2).生態(tài)基質(zhì)組和礫石組樣本在橫坐標(biāo)上距離達(dá)到0.7以上, 在縱坐標(biāo)上的距離為0.4左右, 兩組樣本間微生物群落組成差異較大.
脫氮微生物相對豐度差異分析：生態(tài)基質(zhì)組相對豐度超過1%的主要菌屬有34個, 礫石組僅有9個.各樣品中主要的菌屬分布情況如圖 8所示.從圖 8可以看出, 生態(tài)基質(zhì)組中的主要菌屬包括假單胞菌屬(Pseudomonas)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)、Mangroviflexus、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)和熱單胞菌屬(Thermomonas);礫石組中的主要菌屬包括微桿菌屬(Exiguobacterium)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas).
生態(tài)基質(zhì)組和礫石組樣本中的假單胞菌屬(Pseudomonas)、熱單胞菌屬(Thermomonas)、亞硝化單胞菌(Nitrosomonas)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)、Dechloromonas、陶厄氏菌屬(Thauera)、硝化菌屬(Nitrobacter)中均包含具有脫氮作用的菌種.以上脫氮菌屬在生態(tài)基質(zhì)組和礫石組樣本中的相對豐度差異見表 5.由表 5可以看出, 生態(tài)基質(zhì)組高通量樣本中具有亞硝化、硝化作用的菌屬相對豐度為0.01%, 具有反硝化作用的菌屬相對豐度為30.38%;礫石組樣本中具有亞硝化、硝化作用的菌屬相對豐度為0.2%, 具有反硝化作用的菌屬相對豐度為13.14%.
從高通量分析結(jié)果可以看出, 生態(tài)基質(zhì)組反應(yīng)器內(nèi)具有反硝化作用的菌屬相對豐度顯著高于對照組, 生態(tài)基質(zhì)釋放的碳源有利于異養(yǎng)反硝化微生物的生長繁殖.
3.3.4 微生物物種與脫氮效果相關(guān)分析
使用SPSS 19.0軟件對兩組樣本中菌屬相對豐度數(shù)據(jù)與TN去除率數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析, 結(jié)果顯示, 熱單胞菌屬(Thermomonas)、Mangroviflexus、固氮螺菌屬(Azospira)和叢毛單胞菌屬(Comamonas)4個菌屬的相對豐度與TN去除率有顯著相關(guān)性(p<0.05), 其中, 熱單胞菌屬(Thermomonas)和叢毛單胞菌屬(Comamonas)中均包含具有反硝化脫氮作用的菌種;固氮螺菌屬(Azospira)具有同化固氮的作用, 使水體中的無機(jī)氮轉(zhuǎn)化為菌體內(nèi)的物質(zhì);Mangroviflexus菌屬是否具有脫氮作用目前還不明確, 需要進(jìn)一步研究.
4 結(jié)論
1) 采用緩釋碳源生態(tài)基質(zhì)作為填料進(jìn)行生物反硝化脫氮, 可在保證出水有機(jī)物濃度沒有明顯升高的前提下有效降低低碳氮比水體中的氮濃度, 并避免了NO2--N和NO3--N的積累, 其中, TN去除率可達(dá)到60%以上, NO2--N和NO3--N去除率達(dá)到90%以上.
2) 生態(tài)基質(zhì)顆粒釋放的碳源可提高系統(tǒng)內(nèi)碳氮比, 促進(jìn)反硝化過程第2階段反應(yīng)的進(jìn)行, 避免水體中NO2--N的積累;此外, 生態(tài)基質(zhì)顆粒實現(xiàn)了玉米芯碳源與微生物生長載體的結(jié)合, 是水污染凈化材料的一次創(chuàng)新。
3) 高通量分析結(jié)果表明, 與分解纖維素有關(guān)的Cellulosilyticum菌屬和梭狀芽孢桿菌(Clostridium)菌屬的出現(xiàn)說明生態(tài)基質(zhì)確實釋放了纖維素碳源, 纖維素分解后的單糖產(chǎn)物有利于異養(yǎng)反硝化微生物的生長繁殖, 使生態(tài)基質(zhì)組中具有反硝化脫氮功能的熱單胞菌屬(Thermomonas)和叢毛單胞菌屬(Comamonas)相對豐度遠(yuǎn)高于對照組;與TN去除率具有顯著相關(guān)性(p<0.05)的Mangroviflexus菌屬是否具有脫氮作用有待更多的研究證實.
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